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免疫共沉淀

2010/1/31 [3406]

免疫共沉淀
    一 原理:
    IP是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌蛋白質(zhì)的“prorein A"特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的FC片段的現(xiàn)象活用開發(fā)出來的方法。目前多用精制的prorein A預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上,使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后,beads上的prorein A就能吸附抗原達(dá)到精制的目的。
    實驗zui需要注意點就是抗體的性質(zhì)。抗體不同和抗原結(jié)合能力也不同,免染能結(jié)合未必能用在IP反應(yīng)。建議仔細(xì)檢查抗體的說明書。特別是多抗的特異性是問題。
    其次,要注意溶解抗原的緩沖液的性質(zhì)。多數(shù)的抗原是細(xì)胞構(gòu)成的蛋白,特別是骨架蛋白,緩沖液必須要使其溶解。為此,必須使用含有強界面活性劑的緩沖液,盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結(jié)合。另一面,如用弱界面活性劑溶解細(xì)胞,就不能充分溶解細(xì)胞蛋白。即便溶解也產(chǎn)生與其它的蛋白結(jié)合的結(jié)果,抗原決定族被封閉,影響與抗體的結(jié)合,即使IP成功,也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結(jié)果。
    再次,為防止蛋白的分解,修飾,溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑,低溫下進(jìn)行實驗。
    每次實驗之前,首先考慮抗體/緩沖液的比例??贵w過少就不能檢出抗原,過多則就不能沉降在beads上,殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原,過多則抗原被稀釋。欲速則不達(dá),確定好比例很必要。(待續(xù))
    二 準(zhǔn)備:
    器械:    微量高速冷凍離心機    移液槍    旋轉(zhuǎn)盤    電泳設(shè)備    vortex震蕩器
    液氮及組織粉碎器    eppentube
    試劑:    細(xì)胞或組織    蛋白定量kit    SDS電泳試劑    抗體(單抗時選擇protein G,二抗選擇抗鼠Ig兔血清)    PBS    NaN3    proteinA sapharose
    試劑配制
    抗原蛋白溶解緩沖液
    1.RIPA緩沖液 (zui終濃度)
    1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)
    5MNacl 15ml (150mM)
    0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)
    20%TritonX-100 25ml (1%)
    10% DOC 50ml (1%)
    10%SDS 5ml ( o.1%)
    TLCK 18.5mg (0.1mM)
    TPCK 35mg (0.2mM)
    DDW 395ml
    toal 500ml
    另外,使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精,濃度100mM,-20度遮光保存。注意不易溶于水)
    2.NP40 lysis 緩沖液
    1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)
    5MNacl 15ml (150mM)
    0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)
    20%NP40 25ml (1%)
    TLCK 18.5mg (0.1mM)
    TPCK 35mg (0.2mM)
    DDW 450ml
    toal 500ml
    使用前加1mM的PMSF
    注意點:
    *Tris緩沖劑PH隨溫度變化,高濃度鹽酸滴定時發(fā)熱,冷卻后PH增高。
    *反復(fù)使用PMSF要注意保管方法。
    *1和2的緩沖劑的區(qū)別在于界面活性劑。TritonX-100,NP40是非離子界面活性劑,作用溫和,,DOC
*兩方都有EDTA,對抗原而言,二價離子Mg,Ca等是必要的。根據(jù)自己需要調(diào)節(jié)。EDTA用NaOH滴定。
    Protocol
    1. 調(diào)制protein A sapharose
    protein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS
    離心2000轉(zhuǎn)2分,去上清,在沉淀加0.02%NaN3的PBS,離心后去上清,重復(fù)2次,zui后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS,冷藏保存
    用單抗做一抗時,把protein A sapharose先用抗鼠Ig兔血清處理(每50ulprotein A sapharose用1-5ul血清)。旋轉(zhuǎn)1-2h,混勻后,再離心1-2s去上清后,加PBS,vortex混合,離心去上清,重復(fù)二次加含0.02%NaN3的PBS到原來體積,冷存。避免長期保存。
    2.抗原的檢出
    以下操作全在冰面或4度進(jìn)行去除細(xì)胞培養(yǎng)液,用冷PBS洗一次。加RIPA,溶解后,轉(zhuǎn)移到eppentube中用vortex混勻。RIPA的量:6cm的培養(yǎng)皿加1 ml(蛋白質(zhì)的量為500mg/ml),組織塊用液氮粉碎,在緩沖劑中搗勻,蛋白定量。
    30m,15000rpm離心,上清轉(zhuǎn)移到新tube 。不用移液槍,直接從tube倒進(jìn)另一個tube
往上清加抗體,1ml加2-5ul抗體,冷室內(nèi)旋轉(zhuǎn)混勻1h加protein A sapharose50ul,再混勻1h5000rpm離心1s,使sapharose沉淀,去上清。往sapharose加RIPA,vortex 混勻,離心,去上清。重復(fù)4次洗凈。
    加電泳用 sample 緩沖液40ul,2m煮沸,泳動后,固定/干燥膠,現(xiàn)像。
    3.注意點
    A:不熟練使用移液槍,會混入沉淀的不溶性蛋白,使實驗失敗。對無論怎么也除不去的混入蛋白,只使用上清的上半部,或用超速離心機。
    B:對電泳的非特異條帶,zui后可依次用含300mM,1omMNaCl的RIPA洗凈各一次。(完)
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