微生物染色的基本原理：是借助物理因素和化學因素的作用而進行的。物理因素如細胞及細胞物質對染料的毛細現(xiàn)象、滲透、吸附作用等?；瘜W因素則是根據(jù)細胞物質和染料的不同性質而發(fā)生地各種化學反應。酸性物質對于堿性染料較易吸附，且吸附作用穩(wěn)固；同樣，堿性物質對酸性染料較易于吸附。如酸性物質細胞核對于堿性染料就有化學親和力，易于吸附。但是，要使酸性物質染上酸性材料，必須把它們的物理形式加以改變（如改變pH值），才利于吸附作用的發(fā)生。相反，堿性物質（如細胞質）通常僅能染上酸性染料，若把它們變?yōu)檫m宜的物理形式，也同樣能與堿性染料發(fā)生吸附作用。

影響染色的其它因素，還有菌體細胞的構造和其外膜的通透性，如細胞膜的通透性、膜孔的大小和細胞結構完整與否，在染色上都起一定作用。此外，培養(yǎng)基的組成、菌令、染色液中的電介質含量和pH、溫度、藥物的作用等，也都能影響細菌的染色。

染料的種類：染料可按其電離后染料離子所帶電荷的性質，分為酸性染料、堿性染料和中性（復合）染料三大類。

1、酸性染料：這類染料電離后染料離子帶負電，如伊紅、剛果紅、藻紅、苦味酸和酸性復紅等，可與堿性物質結合成鹽。當培養(yǎng)基因糖類分解產酸使pH值下降時，細菌所帶的正電荷增加，這時選擇酸性染料，易被染色。

2、堿性染料：這類染料電離后染料離子帶正電，可與酸性物質結合成鹽。微生物實驗室一般常用的堿性染料有美蘭、甲基紫、結晶紫、堿性復紅、中性紅、孔雀綠和蕃紅等，在一般的情況下，細菌易被堿性染料染色。

3、中性（復合）染料：酸性染料與堿性染料的結合物叫做中性（復合）染料，如瑞脫氏（Wright）染料和基姆薩氏（Gimsa）染料等，后者常用于細胞核的染色。

瑞氏染液及其配制

1、瑞氏染料是由堿性染料美藍（Methvlem blue和酸性染料伊紅（EostmY）合稱伊紅美藍染料即瑞氏（美藍－伊紅Y）染料。

伊紅鈉鹽的有色部分為陰離子，無色部分為陽離子，其有色部分為酸性，故稱伊紅為酸性染料。美藍通常為氯鹽是堿性的，美藍的中間產物結晶為三氯化鎂復鹽，其有色部分為陽離子，無色部分為陰離子，恰與伊紅鈉鹽相反。

2、用甲醇作瑞氏染料溶劑，即成瑞氏染液。甲醇是瑞氏染料良好溶劑，有兩種作用：

（1）甲醇使瑞氏染料中美藍（ M ）與伊紅（ E ）在溶液中離解，可使細胞成分選擇性吸附其中的有色物質而著色。 

（2）甲醇具有強大的脫水力，可將細胞固定在一定形態(tài)及增加細胞結構的表面積，提高細胞對染料吸收作用，同時由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升溫，加速染色反應。

3. 瑞氏染液配制：

（1） 瑞氏染液配制： 瑞氏染料 830gm 或 1g

甲醇（ AR ） 500ml 或 600ml

先稱干燥（事先放入溫箱干燥過夜）瑞氏染料放置乳缽內， 用乳棒輕輕 敲碎染料成粉末，再行研磨至聽不到研芝麻聲 即呈細粉末，加少許甘油或甲醇溶解研磨，使染料在乳缸內顯“一面鏡”光澤，而無染料粉粒沉著，再加較多量甲醇研磨呈一面鏡光亮，靜置片刻，將上層液體倒入一 清潔儲存瓶內（用甲醇空瓶），再加甲醇研磨，重復數(shù)次，直至乳缽內染料及甲醇用完為止，搖勻，密封瓶口，存室溫暗處，儲存愈久，則染料溶解、分解就越好，一般儲存 3 個月以上為佳。

（2） 緩沖液：

1） 緩沖液作用：染色對氫離子濃度是十分敏感的，據(jù)觀察 pH 值的改變，可使蛋白質與染料形成的化合物重新離解。緩沖液須保持 一定的 pH 使染色穩(wěn)定， PBS 的 pH 一般在 6.4~6.8 ，偏堿性染料可與緩沖液中 酸基起 中和作用，偏酸性染料則與緩沖液中的堿基起中和作用，使 pH 恒定。

2） 緩沖液配制（ pH6.4~6.8 ，弱酸性）：

　　配方 1 ： 配方 2 ：

　　1% KH2PO4 30ml M/15 KH2PO4 73.5 ml

　　1% Na2HPO4 20ml M/15 Na2HPO4 26.5ml

　　H2O（ 新鮮 ） 加至 1000ml

　　置室溫黑暗處，瓶口密封，防止霉菌污染，如有污染則應報廢。