本試劑盒僅供研究使用                                       

ELISA法定量測(cè)定人血清、血漿、痰液、細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中TNF-α含量。

腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactor，TNF）是一種具有多種生物活性的細(xì)胞因子。人TNF-α基因編碼前體蛋白，其信號(hào)肽將前體蛋白固定在細(xì)胞膜上，成為具有活性的跨膜干擾素（TNF），分子質(zhì)量為26×10³，經(jīng)酶切去除信號(hào)肽生成分泌型TNF-α，分子質(zhì)量為17×10³。TNF-α細(xì)胞來源廣泛，包括各種免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、星形細(xì)胞、成骨細(xì)胞等。

   TNF-α具有廣泛的生物學(xué)活性，如：參與炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答，抗腫瘤，參與內(nèi)毒素性休克等病理過程，引起惡病質(zhì)等。其具有雙重作用，,一方面在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，機(jī)體生理功能和抗感染等方面發(fā)揮重要作用，另一方面若持續(xù)釋放或產(chǎn)生過多則會(huì)引起發(fā)熱!、休克、惡病質(zhì)等，同時(shí)TNF-α可進(jìn)一步誘導(dǎo)IL-6、IL-8、IL-10等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這些促炎性細(xì)胞因子參與體內(nèi)急性反應(yīng)、發(fā)熱反應(yīng)、引起趨化肽釋放等，還可使內(nèi)皮細(xì)胞活化而導(dǎo)致血管通透性增加。

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本中TNF-α水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入TNF-α抗原、生物素化的抗大鼠TNF-α抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的。顏色的深淺和樣品中的TNF-α呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。

1.         酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.         標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為10 ng/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成10 ng/mL，5 ng/mL ，2.5 ng/mL，1.25 ng/mL，0.62 ng/mL，0.31 ng/mL，0.16 ng/mL，其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/mL，臨用前15分鐘內(nèi)配制。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶。

4.         檢測(cè)稀釋液A：1×10ml/瓶。

5.         檢測(cè)稀釋液B：1×10ml/瓶。

6.         檢測(cè)溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測(cè)稀釋液A1：100稀釋。稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100ul），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測(cè)溶液A加99ul檢測(cè)稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。

7.         檢測(cè)溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測(cè)稀釋液B1：100稀釋。稀釋方法同檢測(cè)溶液A。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶。

9.         濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10.     終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

1．細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請(qǐng)離心后收集上清，并將標(biāo)本保存于-20℃，且應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2．血清：標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

4. 痰液處理：選擇痰液中較為粘稠部分稱重, 加兩倍于痰量的011%DTT（二硫蘇糖醇）37℃恒溫水浴振蕩5min,再加入兩倍于痰量的PBS緩沖液繼續(xù)振蕩15~20min,150目的金屬絲網(wǎng)過濾,1500r/min離心10min吸取上清液-20℃冷凍保存。

各試劑在使用前平衡至室溫。

1.         加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測(cè)樣品100ul，注意不要有氣泡，輕輕混勻，酶標(biāo)板加上蓋，37℃反應(yīng)120分鐘。

2.         棄去液體，甩干，不用洗滌。

3.         每孔加檢測(cè)溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘。洗板3次，350ul/每孔，甩干。

4.         每孔加檢測(cè)溶液B工作液 100ul，37℃，60分鐘，洗板5次，甩干。

5.         依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色30分鐘（此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯）。

6.         依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時(shí)蘭色立轉(zhuǎn)）。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。

注：

1． 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH₂SO4。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。

2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層

吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
    自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。

    本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的人TNF-α，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

1． 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

2． 一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

3． 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。

4． 如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5．在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液工作液時(shí)，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。

6．底物請(qǐng)避光保存。

0.15 ng/mL -10 ng/mL

1．試劑盒保存：-20℃（較長時(shí)間不用時(shí)）；2-8℃（頻繁使用時(shí)）。

2．有效期：6個(gè)月

3．濃洗滌液會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。

4．中、英文說明書可能會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說明書為準(zhǔn)。

5．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。