原位雜交
基本定義
將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱為原位雜交！使用DNA或者RNA探針來檢測與其互補(bǔ)的另一條鏈在細(xì)菌或其他真核細(xì)胞中的位置。

RNA原位雜交
1、RNA原位核酸雜交又稱RNA組織化學(xué)或RNA。該技術(shù)是指運(yùn)用cRNA或寡核苷酸等探針檢測細(xì)胞和組織內(nèi)RNA表達(dá)的一種技術(shù)。
2、基本原理是：在細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)保持不變的條件下，用標(biāo)記的已知的RNA核苷酸片段，按核酸雜交中堿基配對(duì)原則，與待測細(xì)胞或組織中相應(yīng)的基因片段相結(jié)合（雜交），所形成的雜交體（Hybrids）經(jīng)顯色反應(yīng)后在光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA技術(shù)經(jīng)不斷改進(jìn)，其應(yīng)用的領(lǐng)域已遠(yuǎn)超出DNA技術(shù)。尤其在基因分析和診斷方面能作定性、定位和定量分析，已成為zui有效的分子病理學(xué)技術(shù)，同時(shí)在分析低豐度和罕見的mRNA表達(dá)方面已展示了分子生物學(xué)的一重要方向。

FISH
FISH是技術(shù)大家族中的一員，因其所用探針被熒光物質(zhì)標(biāo)記（間接或直接）而得名，該方法在80年代末被發(fā)明，現(xiàn)已從實(shí)驗(yàn)室逐步進(jìn)入臨床診斷領(lǐng)域。
基本原理是熒光標(biāo)記的核酸探針在變性后與已變性的靶核酸在退火溫度下復(fù)性；通過熒光顯微鏡觀察熒光信號(hào)可在不改變被分析對(duì)象（即維持其原位）的前提下對(duì)靶核酸進(jìn)行分析。DNA熒光標(biāo)記探針是其中zui常用的一類核酸探針。利用此探針可對(duì)組織、細(xì)胞或染色體中的DNA進(jìn)行染色體及基因水平的分析。熒光標(biāo)記探針不對(duì)環(huán)境構(gòu)成污染，靈敏度能得到保障，可進(jìn)行多色觀察分析，因而可同時(shí)使用多個(gè)探針，縮短因單個(gè)探針分開使用導(dǎo)致的周期過程和技術(shù)障礙。

例子
　　以菌落為例：
　　對(duì)分散在若干個(gè)瓊脂平板上的少數(shù)菌落（100-200）進(jìn)行克隆篩選時(shí)，可采用本方法。將這些菌落歸并到一個(gè)瓊脂主平板以及已置于第二個(gè)瓊脂平板表面的一張硝酸纖維素濾膜上。經(jīng)培養(yǎng)一段時(shí)間后，對(duì)菌落進(jìn)行原位裂解。主平板應(yīng)貯存于4℃直至得到篩選結(jié)果。
1. 將少數(shù)菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上
　?。?） 在含有選擇性抗生素的瓊脂平板上放一張硝酸纖維素濾膜。
　?。?） 用無菌牙簽將各個(gè)菌落先轉(zhuǎn)移至濾膜上,再轉(zhuǎn)移至含有選擇性抗生素但未放濾膜的瓊脂主平板上。應(yīng)按一定的格子進(jìn)行劃線接種（或打點(diǎn)）。每菌落應(yīng)分別劃線于兩個(gè)平板的相同位置上。zui后，在濾膜和主平板上同時(shí)劃一個(gè)含有非重組質(zhì)粒（如pBR322）的菌落。
　?。?） 倒置平板,于37℃培養(yǎng)至劃線的細(xì)菌菌落生長到0.5-1.0mm的寬度。
　　（4） 用已裝防水黑色繪圖墨水的注射器針頭穿透濾膜直至瓊脂,在3個(gè)以上的不對(duì)稱位置作標(biāo)記。在主平板大致相同的位置上也作上標(biāo)記。
　?。?） 用Parafilm膜封好主平板,倒置貯放于4℃,直至獲得雜交反應(yīng)的結(jié)果。
　　（6） 裂解細(xì)菌,按本段下面所述方法,使釋放的DNA結(jié)合于硝酸纖維素濾膜。

2. 菌落的裂解及DNA結(jié)合于硝酸纖維素濾膜
　?。?） 在一張保鮮膜上制作一個(gè)裝有0.5mol/L NaOH的小洼（0.75ml）,使菌落面朝上,將濾膜放到小洼上,展平保鮮膜,使濾膜均勻濕潤,讓濾膜留于原處2-3分鐘。
　?。?） 用干紙巾從濾膜的下方吸干濾膜,用一張新的保鮮膜和新配制的0.5mol/L NaOH重復(fù)步驟（1）。
　?。?） 吸干濾膜,將濾膜轉(zhuǎn)移到新的帶有1mol/L Tris·Cl（pH7.4）的保鮮膜洼上。5分鐘后吸干濾膜, 再重復(fù)一次該步驟。
　　（4） 吸干濾膜,把它轉(zhuǎn)移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris·Cl （pH7.4）的保鮮膜小洼上5分鐘后吸干濾膜,轉(zhuǎn)移到一張干的濾紙上,置于室溫20-30分鐘,使濾膜干燥。
　?。?） 將濾膜夾在兩張干的濾紙之間,在真空烤箱中于80℃干烤2小時(shí),固定DNA。
　?。?） 將固定在膜上的DNA與32 P標(biāo)記的RNA進(jìn)行雜交。
3.雜交　
（1） 盛有2×SSC的塑料盤同，將干烤的濾膜飄浮在液面上,*浸濕5分鐘。
　?。?） 將濾膜轉(zhuǎn)到200ml預(yù)洗液的玻璃皿中。濾膜何疊在一起,放于溶液中。用保鮮膜蓋住玻璃皿,放到位于培養(yǎng)箱內(nèi)的旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上。于50℃處理30分鐘。在這一步及以后的所有步驟中,應(yīng)緩緩搖動(dòng)濾膜,防止它們粘在一起。
　?。?） 用泡過預(yù)洗液的吸水棉紙輕輕地從膜表面拭去細(xì)菌碎片,以降低雜交背景而不影響陽性雜交信號(hào)的強(qiáng)度和清晰度。
　?。?） 將濾膜轉(zhuǎn)到盛有150ml預(yù)雜交液的玻璃中,在適宜溫度（即在水溶液中雜交時(shí)用68℃，而在50%甲酰胺中雜交時(shí)用42℃）下,預(yù)雜交1-2小時(shí)。
　?。?） 將32 P標(biāo)記的雙鏈DNA探針于100℃加熱5分鐘,迅速置于冰浴中。單鏈探針不必變性。將探針加到雜交袋中雜交過夜。雜交期間，盛濾膜的容器應(yīng)蓋嚴(yán)，以防液體蒸發(fā)。
　?。?） 雜交結(jié)束后,去除雜交液,立即于室溫把濾膜放入大體積（300-500ml）的2×SSC和0.1% SDS溶液中,輕輕振搖5分鐘，并將濾膜至少翻轉(zhuǎn)一次。重復(fù)洗一次，同時(shí)應(yīng)避免膜干涸。
　?。?）68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜兩次,每次1-1.5小時(shí)。此時(shí)已可進(jìn)行放射自顯影。如背景很高或?qū)嶒?yàn)要求嚴(yán)格的洗膜條件,可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃將濾膜浸泡60分鐘。
　?。?） 把濾膜放在紙巾上于室溫晾干后,把濾膜（編號(hào)面朝上）放在一張保鮮膜上,并在保鮮膜上作幾個(gè)不對(duì)稱的標(biāo)記,以使濾膜與放射性自顯影片位置對(duì)應(yīng)。
　　（9） 用第二張保鮮膜蓋住濾膜。加X光片并加上增感屏于-70℃曝光12-16小時(shí)。
　?。?0） 底片顯影后,在底片上貼一張透明硬紙片。在紙上標(biāo)記陽性雜交信號(hào)的位置,同時(shí)在不對(duì)稱分布點(diǎn)的位置上作出標(biāo)記?？蓮牡灼先∠峦该骷?通過對(duì)比紙上的點(diǎn)與瓊脂上的點(diǎn)來鑒定陽性菌落。

的應(yīng)用
　?、偌?xì)胞特異性mRNA轉(zhuǎn)錄的定位,可用于基因圖譜，基因表達(dá)和基因組進(jìn)化的研究；
　　②感染組織中病毒DNA/RNA的檢測和定位，如EB病毒mRNA、人類乳頭狀瘤病毒和巨細(xì)胞病毒DNA的檢測；
　?、郯┗?、抑癌基因及各種功能基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)及其變化的檢測；
　?、芑蛟谌旧w上的定位；
　?、輽z測染色體的變化，如染色體數(shù)量異常和染色體易位等；
　　⑥分裂間期細(xì)胞遺傳學(xué)的研究，如遺傳病的產(chǎn)前診斷和某些遺傳病基因攜帶者的確定，某些腫瘤的診斷和生物學(xué)劑量測定等。

的意義
　?。涸谘芯緿NA分子復(fù)制原理的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種技術(shù)。其基本原理是兩條核苷酸單鏈片段，在適宜的條件下，能過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA 雙鍵分子的特點(diǎn)，應(yīng)用帶有標(biāo)記的（有放射性同位素，如3H、35S、32P、熒光素生物素、地高辛等非放射性物質(zhì)）DNA或RNA片段作為核酸探針，與組織切片或細(xì)胞內(nèi)待測核酸（RNA或DNA）片段進(jìn)行雜交，然后可用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的mRNA或DNA 的存在并定位；用技術(shù)，可在原位研究細(xì)胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達(dá)。此方法有很高的敏感性和特異性，可進(jìn)一步從分子水平來探討細(xì)胞的功能表達(dá)及其調(diào)節(jié)機(jī)制。已成為當(dāng)今細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)研究的重要手段。