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研域上海生物為您分享細(xì)胞技術(shù)分析

2023-06-27 [695]

細(xì)胞技術(shù)作為一項生命科學(xué)領(lǐng)域的重要技術(shù),想要使用好自然是不容易。相信不少小伙伴在使用幾次之后,還是會有云里霧里的感覺。真正想掌握好一門技術(shù),還是得從基礎(chǔ)部分就做好。

1.如何搭配流式抗體熒光標(biāo)記?

流式抗體熒光標(biāo)記搭配主要由3個因素決定:流式細(xì)胞儀能檢測多少個通道、需要同時檢測多少個指標(biāo)、廠家的抗體有多少種熒光標(biāo)記。流式細(xì)胞儀的通道越多,那么同一份樣本能同時檢測的表面/胞內(nèi)/核內(nèi)蛋白就越多。Calibur為例說明:Calibur的FL1通道選擇了FITC就不能選擇AlexaFluro488,或者選擇了Alexa Fluro488就不能選FITC;Calibur的FL3通道盡管能檢測PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7五個熒光素,但是我們搭配的時候只能選擇其中1個。

2.如果檢測的指標(biāo)數(shù)目超過了流式細(xì)胞儀的通道,怎么辦?

如果需要做5個指標(biāo),而流式細(xì)胞儀只能做4個通道,首先將指標(biāo)歸成2類,再將樣本分成2份,分別檢測。比如需要同時檢測CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma,可以將樣本分成兩份,第1份加CD3、CD4、CD8 和IL-4,而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。具體的歸類方式可根據(jù)課題的設(shè)計來進(jìn)行。

3.抗體染色的細(xì)胞不能立即檢測該如何處理?

如果實驗對細(xì)胞活性要求比較高,如凋亡實驗,必須盡快檢測;如果實驗對細(xì)胞活性要求不高,可以使用含有4%多聚甲醛的PBS固定樣本30分鐘,固定后的細(xì)胞4℃過夜保存,次日檢測。

4.同型對照的作用是什么?

抗體有時會和非抗原結(jié)合,可能會因為非特異的蛋白-蛋白相互作用結(jié)合細(xì)胞內(nèi)成分,因為疏水作用結(jié)合脂肪,也可能會結(jié)合一些細(xì)胞表面表達(dá)的抗體受體。比如,IgG亞型的抗體會結(jié)合細(xì)胞表面的Fc受體,如CD16、CD32和CD64。理想條件下,各種類型的非特異性結(jié)合都可以通過蛋白(BSA、牛奶或動物血清)來阻斷。Fc受體的結(jié)合則可以通過與含免疫球蛋白的血清預(yù)孵育來阻斷。一個抗體非特異性相互作用和受體結(jié)合的情況,可以用無關(guān)抗原的相同亞型抗體來比照。

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